Revista Polo del Conocimiento


Open Journal Systems

 

 

 

Evaluacin del perfil de aminocidos de una premezcla de polvo de arveja (Pisum Sativum) y avena (avena sativa)

 

Evaluation of the amino acid profile of a premix of pea powder (Pisum Sativum) and oats (avena sativa)

 

Avaliao do perfil de aminocidos de uma pr-mistura de p de ervilha (Pisum Sativum) e aveia (avena sativa)

 

Carolina Alicia Paz-Ypez I
cpaz@uagraria.edu.ec
https://orcid.org/0000-0001-9547-2817
Josseline Tatiana Mendoza-Lozano II
josseline.mendoza.lozano@uagraria.edu.ec
https://orcid.org/0000-0002-5810-0931
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


Correspondencia: [email protected]

 

 

Ciencias Tcnicas y Aplicadas

Artculo de Investigacin

 

* Recibido: 23 de septiembre de 2022 *Aceptado: 27 de octubre de 2022 * Publicado: 01 de noviembre de 2022

 

 

        I.            Universidad Agraria del Ecuador, Guayaquil, Ecuador.

     II.            Universidad Agraria del Ecuador, Guayaquil, Ecuador.

 

 

 


 

Resumen

En Ecuador la desnutricin es un problema latente en nios y adolescentes con un ndice del 15 % al 19,1 %, y en adultos con un ndice del 1,9 %. Varios estudios se han enfocado en disminuir este ndice, siendo entre los ms importantes el desarrollo de mezclas de alimentos vegetales que contengan aminocidos completos. En esta investigacin se desarrollaron tres formulaciones utilizando un cereal (avena) y una leguminosa (arveja), con el fin de crear una mezcla que contenga los aminocidos esenciales. Las formulaciones se realizaron considerando las siguientes proporciones (arveja:avena, respectivamente), F1: 40:60, F2: 50:50, y F3: 60:40. Se les evalu el contenido de protenas y posteriormente se realiz un anlisis estadstico para seleccionar la formulacin de mayor contenido proteico. El diseo experimental se realiz considerando un factor, tres tratamientos y 5 repeticiones, donde, el factor era la proporcin arveja:avena. Como resultado del diseo experimental se obtuvo que la formulacin 1 tuvo el mayor contenido proteico y con ello se determin el perfil de aminocidos presentando valores en g AA/ 100 g muestra; His 0,30, Ile 0,45, Leu 0,86, Lys 0,76, Met 0,19, Cys 0,49, Phe 0,60, Tyr 0,52, Thr 0,44, Trp 1,27, Val 0,57 y un anlisis microbiolgico para validar su consumo. Se concluye que la formulacin 1 cumpla con el perfil de aminocidos esenciales propuesto por la FNB/IOM y la FAO para nios de 1 a 3 aos, adolescentes y adultos, exceptuando lactantes. Adicionalmente, los resultados microbiolgicos indicaron que la premezcla es apta para el consumo humano.

Palabras claves: Aminocidos; Arveja; Avena; Protenas.

 

Abstract

In Ecuador, malnutrition is a latent problem in children and adolescents with a rate of 15% to 19.1%, and in adults with a rate of 1.9%. Several studies have focused on reducing this index, one of the most important being the development of vegetable food mixtures that contain complete amino acids. In this research, three formulations were developed using a cereal (oats) and a legume (pea), in order to create a mixture containing essential amino acids. The formulations were made considering the following proportions (pea:oats, respectively), F1: 40:60, F2: 50:50, and F3: 60:40. Their protein content was evaluated and subsequently a statistical analysis was performed to select the formulation with the highest protein content. The experimental design was carried out considering one factor, three treatments and 5 repetitions, where the factor was the pea:oat ratio. As a result of the experimental design, it was obtained that formulation 1 had the highest protein content and with it the amino acid profile was determined, presenting values ​​in g AA/100 g sample; His 0.30, Ile 0.45, Leu 0.86, Lys 0.76, Met 0.19, Cys 0.49, Phe 0.60, Tyr 0.52, Thr 0.44, Trp 1.27, Val 0.57 and a microbiological analysis to validate its consumption. It is concluded that formulation 1 complied with the profile of essential amino acids proposed by the FNB/IOM and the FAO for children from 1 to 3 years of age, adolescents and adults, except infants. Additionally, the microbiological results indicated that the premix is ​​suitable for human consumption.

Keywords: Amino acids; Vetch; Oatmeal; Proteins.

 

Resumo

No Equador, a desnutrio um problema latente em crianas e adolescentes com taxa de 15% a 19,1% e em adultos com taxa de 1,9%. Vrios estudos tm focado na reduo desse ndice, sendo um dos mais importantes o desenvolvimento de misturas alimentares vegetais que contenham aminocidos completos. Nesta pesquisa, foram desenvolvidas trs formulaes utilizando um cereal (aveia) e uma leguminosa (ervilha), a fim de criar uma mistura contendo aminocidos essenciais. As formulaes foram feitas considerando as seguintes propores (ervilha:aveia, respectivamente), F1: 40:60, F2: 50:50 e F3: 60:40. O teor de protena foi avaliado e posteriormente foi realizada uma anlise estatstica para selecionar a formulao com o maior teor de protena. O delineamento experimental foi realizado considerando um fator, trs tratamentos e 5 repeties, onde o fator foi a relao ervilha:aveia. Como resultado do delineamento experimental, obteve-se que a formulao 1 apresentou o maior teor de protena e com ela foi determinado o perfil de aminocidos, apresentando valores em g AA/100 g amostra; His 0,30, Ile 0,45, Leu 0,86, Lys 0,76, Met 0,19, Cys 0,49, Phe 0,60, Tyr 0,52, Thr 0,44, Trp 1,27, Val 0,57 e uma anlise microbiolgica para validar seu consumo. Conclui-se que a formulao 1 atendeu ao perfil de aminocidos essenciais proposto pela FNB/IOM e pela FAO para crianas de 1 a 3 anos, adolescentes e adultos, exceto lactentes. Alm disso, os resultados microbiolgicos indicaram que a pr-mistura adequada para consumo humano. Palavras-chave: Aminocidos; Ervilhaca; Aveia; Protenas.

 

Introduccin

La Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura (FAO) define la malnutricin como una condicin fisiolgica anormal que resulta del consumo insuficiente, excesivo o desequilibrado de macronutrientes que proveen energa (hidratos de carbono, protenas y grasas) y micronutrientes (vitaminas y minerales) que son esenciales para el crecimiento y el desarrollo cognitivo de una persona (Organizacin de las Naciones Unidas para la Alimentacin y la Agricultura, 2014). La malnutricin se divide en tres tipos: desnutricin, deficiencia de micronutrientes, sobrepeso y obesidad ((Organizacin Mundial de la Salud [OMS], 2020).

De acuerdo con la FAO (2011), la desnutricin es causada por el consumo insuficiente de alimentos que proveen macronutrientes (carbohidratos, protenas, grasas) para satisfacer las necesidades de energa alimentaria. As como tambin, puede originarse por la mala absorcin de nutrientes como consecuencia de una enfermedad infecciosa (Agencia de la ONU para los refugiados, 2018). La importancia de la protena en la dieta se debe a su capacidad de aportar aminocidos esenciales para la sntesis de protena corporal y su incremento durante el crecimiento. Cuando el aporte de aminocidos es excesivo, el organismo lo utiliza como fuente energtica (Hernndez, 2005). Una limitacin en el aporte de energa o protena conduce a un retraso en el crecimiento conocido como desnutricin. En el adulto, la prdida de protena se asocia con numerosas alteraciones patolgicas y a un aumento en la mortalidad (Martnez y Martnez, 2006).

El ser humano necesita de veinte aminocidos de los cuales once de ellos el organismo los sintetiza, estos se denominan aminocidos no esenciales. Por otra parte, los nueve aminocidos restantes conocidos como esenciales no pueden ser sintetizados por el organismo y deben suministrarse mediante la dieta por medio de las protenas (Mataix, 2013). La calidad de una protena est principalmente determinada por dos factores: digestibilidad y la composicin de aminocidos esenciales de la protena (Institute of Medicine of the National Academies, 2005). Una protena que contenga todos los aminocidos esenciales en concentraciones adecuadas, se denomina protena de alto valor biolgico o protena completa (Cervera, Claps y Rigolfas, 2004; Martnez y Martnez, 2004).

Generalmente, las protenas de alto valor biolgico se obtienen de alimentos de origen animal, dado que las protenas de origen vegetal carecen de uno o ms aminocidos o contienen aminocidos que se encuentran en menor cantidad. Esta deficiencia del aminocido en la protena se conoce como aminocido limitante (Cervera et al., 2004). Un alimento con aminocido limitante no es deseado porque restringe la absorcin completa del resto de aminocidos en el organismo (Institute of Medicine of the National Academies, 2005; Cervera et al., 2004).

En Ecuador, la desnutricin es un problema que no se ha conseguido erradicar desde 1993 (Quiroz et al., 2020). De acuerdo con el informe emitido por la Organizacin de las Naciones Unidas (ONU) correspondiente al ao 2018, en los ltimos tres aos el 7,8 % de los habitantes padecen de desnutricin, aconteciendo como principal causa el desbalance en la dieta diaria por el bajo consumo de carnes, frutas y legumbres (Saltos, 2019). Conforme a la ltima Encuesta Nacional de Salud y Nutricin (ENSANUT) realizada en el ao 2013, el 25,3 % de la poblacin preescolar (0 5 aos) padece de desnutricin crnica (baja estatura para la edad), porcentaje que se ha mantenido hasta la actualidad y que se prev un incremento del 27 % como consecuencia del COVID-19 (Zambrano, 2020).

La misma situacin acontece en la poblacin escolar (5 11 aos) y adolescente (12 19 aos) atribuyndose un ndice de desnutricin del 15 % y 19,1 % respectivamente. Por otra parte, el 1,9 % de los adultos (20 - 60 aos) padecen de desnutricin aguda (bajo peso para la edad) (Freire et al., 2013). Varios estudios acerca de mezclas de alimentos vegetales aminoacdicamente completos se han realizado con el fin de disminuir problemas de desnutricin, promover el consumo de alimentos vegetales u ofrecer alternativas diferentes a las comunes como los alimentos de origen animal.

Santilln (2018) en su trabajo de investigacin, menciona que una correcta formulacin de mezclas a partir de cereales y leguminosas puede llegar a aportar la misma cantidad de aminocidos esenciales que un kilogramo de carne de res. El estudio se orient en encontrar la mejor combinacin de cereal: leguminosa (en base a la calidad aminoacdica) de 144 mezclas alimenticias utilizando 4 tipos de cereales y 4 tipos de leguminosas, con el objetivo de disminuir los ndices de desnutricin infantil. Los cereales considerados para realizar las mezclas fueron: arroz (Oryza sativa), trigo (Triticum aestivum), avena (Avena sativa) y maz (Zea mays); y las leguminosas: chocho (Lupinus mutabilis), arveja (Pisum sativum), lenteja (Lens culinaris) y frijol (Phaseolus vulgaris).

Coila (2020) explica que en la actualidad las personas prefieren una alimentacin vegetariana, sin embargo, la calidad proteica no es ptima para reemplazar los alimentos de origen animal. Por esa razn, mediante el mtodo PDCAAS (Puntuacin de aminocidos corregida por la digestibilidad) y la optimizacin con Design Expert, determin el aporte aminoacdico de varias combinaciones entre granos andinos, cereales y leguminosas. Los factores que fueron considerados para la seleccin de los alimentos en el estudio fueron la composicin qumico proximal, el contenido de aminocidos esenciales y el factor de digestibilidad. Los alimentos seleccionados fueron: tarwi, arroz, caihua, avena, quinua, kiwicha (amaranto), maz, soya, lenteja, garbanzo y haba.

En este contexto de la investigacin, se busca formular una premezcla tipo suplemento con el fin de proporcionar protenas de alto valor biolgico mediante la combinacin de un cereal (avena) y una leguminosa (arveja) para ser ofertado como una alternativa diferente a los productos con contenido proteico ya existentes.

Las protenas tienen la capacidad de complementarse entre s, al mezclar protenas de alto y bajo valor biolgico, o protenas de bajo valor biolgico con distintos aminocidos limitantes. Mediante la combinacin de protenas, se puede suplir el dficit de aminocidos y potenciar su sntesis en el organismo (Cervera et al., 2004). De acuerdo con el Comit de Nutricin y Alimentos del Instituto de Medicina de Estados Unidos (FNB/IOM), el perfil de aminocidos que debe cumplir una protena de calidad considerando el requerimiento de aminocidos y protenas en nios ≥ 1 ao y dems grupos de edades, es la siguiente: 1,8 % histidina; 2,5 % isoleucina; 5,5 % leucina; 5,1 % lisina; 2,5 % metionina; 4,7 % fenilalanina; 2,7 % treonina; 0,7 % triptfano y 3,2 % valina (Institute of Medicine of the National Academies, 2005).

La presente investigacin se enfoca en la formulacin de una premezcla mediante la combinacin de dos alimentos con aminocidos limitantes diferentes. Los cereales como la avena (Avena sativa) son deficientes en lisina con un valor de 41 45 mg/ g protena (4,1 - 4,5 %), pero completos en metionina con un valor de 15 20 mg/ g protena (1,5 - 2,0 %) (Pettersson et al., 1996). En contraste, las leguminosas como las arvejas (Pisum sativum) son deficientes en metionina con un valor de 10,3 mg/ g protena (1,03 %), pero completos en lisina con un valor de 68,4 mg/ g protena (6,84 %) (Leterme et al., 1990), de manera que pueden complementarse proteicamente (Cervera et al., 2004).

La premezcla puede consumirse de varias maneras debido a su presentacin como polvo. La forma de consumo depender de la necesidad y del gusto de cada persona, sin embargo, por su composicin al contener un cereal y un espesante (goma xantana) puede emplearse como un agregado en preparaciones como sopas, panes, coladas, batidos y galletas. En definitiva, esta premezcla se aprovecha de mejor manera al utilizarse en preparaciones que requieran de una consistencia espesa.

 

Materiales y mtodos

El diseo de investigacin se realiz mediante la propuesta de formulaciones de tres mezclas alimenticias, la cual, mediante anlisis estadstico se seleccion la mejor combinacin en base a la cantidad de protenas. La formulacin seleccionada fue utilizada para realizar la caracterizacin de aminocidos y los anlisis microbiolgicos.

 

Descripcin de los componentes de las formulaciones

Polvo de arvejas (Pisum sativum): Aporta aminocidos esenciales. Contiene altos niveles de lisina y es deficiente en triptfano y en aminocidos azufrados como metionina y cistena.

Harina de avena (Avena sativa): Aporta aminocidos esenciales. Contiene altos niveles de triptfano y aminocidos azufrados como metionina y cistena.

Goma xantana: Es un polisacrido (E 415) procedente de la fermentacin del maz que acta como un espesante. Confiere alta viscosidad al agregarse en preparaciones lquidas como sopas, coladas, jugos, etc. En preparaciones como salsas, lcteos como helados, productos de panadera y pastelera, se lo puede usar como estabilizante o emulsionante

Preservantes (NS-1017S): Es un sistema de preservantes efectivo contra bacterias, mohos y levaduras, en un rango de pH de 5,0 a 6,5. Los componentes qumicos que componen el sistema son:

Propionato de sodio: Es una sal soluble y tiene una efectividad ideal a un pH de 5.0 en la mayora de las aplicaciones contra mohos y algunas bacterias que producen babosidad. Es inefectivo contra levaduras (CFR 184-1784).

Sorbato de potasio: Es efectivo hasta un pH de 6.5 contra levaduras y mohos. Es inefectivo contra bacterias (CFR 182.3640).

Acetato de calcio: Es efectivo hasta un pH de 4,5 contra levaduras y bacterias. Es inefectivo contra mohos (CFR 184.1185).

Cada uno de estos componentes tiene un rango ptimo de pH as como el tipo de microorganismos contra los cuales son efectivos. La combinacin de ellos hace un sistema ms efectivo. Ello favorece una mayor estabilidad del alimento e incrementar su vida til del producto

El desarrollo de la premezcla tipo suplemento se realiz mediante la formulacin de tres tratamientos presentado en la Tabla 1.

 

Figura 1: Tratamientos del diseo experimental

Componentes

Tratamiento 1

(%)

Tratamiento 2

(%)

Tratamiento 3

(%)

Polvo de arveja

39,71

49,6375

59,565

Harina de avena

59,565

49,6375

39,71

Goma Xantana

0,6

0,6

0,6

* Preservantes (NS-1017S)

0,125

0,125

0,125

Total

100

100

100

Porcentajes de los componentes de cada tratamiento.

*Propionato de sodio, Sorbato de potasio, Acetato de calcio

 

El diseo experimental estuvo basado en un diseo completamente aleatorizado (DCA) el cul usa como procedimiento estadstico el anlisis de varianza (ANOVA). El diseo estuvo compuesto de un factor (formulacin de la premezcla), tres tratamientos (niveles) y cinco repeticiones por tratamiento. En total se analizaron 15 datos y se realiz el test de normalidad Shapiro - Wilk para determinar si los datos seguan una distribucin normal y con ello aplicar el diseo completamente aleatorizado (DCA). Si los datos no seguan una distribucin normal, estos deban ser analizados mediante el mtodo no paramtrico Kruskal Wallis.

El anlisis estadstico determin si existan diferencias significativas entre las tres formulaciones con respecto al contenido de protenas. En caso de que hubieran existido diferencias significativas entre los tratamientos, se habra realizado un anlisis de medias de Tukey al 5 % de probabilidad.

Para la obtencin del polvo de arveja se emplearon granos de arveja (Pisum sativum), sorbato de potasio, bolsas de polipropileno de alta densidad. Para la Obtencin de la premezcla se emple polvo de arveja, harina de avena, goma xantana y preservantes: propionato de sodio, sorbato de potasio, acetato de calcio, bolsas de polipropileno de alta densidad. Dentro de los equipos se emplearon tamices, molinos, marmitas, Deshidratador (Model No: ST 04 (T)), balanza.

La obtencin del polvo de arveja (Pisum sativum) se realiz de acuerdo con el diagrama de flujo descrito en la Figura 1.

 

Figura 2: Etapas del proceso de obtencin del polvo de arveja (Pisum sativum)

 

Descripcin de las etapas del proceso de obtencin del polvo de arveja

         Recepcin de materia prima: Se recept la leguminosa en recipientes plsticos para su posterior seleccin, pesados y limpieza.

         Lavado: La limpieza de los granos se realiz por inmersin en una solucin de sorbato de potasio al 1 %. La finalidad del lavado es limpiar el grano de cualquier impureza no visible que pudiera afectar la calidad final del polvo de arveja.

         Seleccin: En esta etapa se realiz la seleccin de los granos de arveja en base a las caractersticas fsicas. Los granos que presentaron contaminacin por insectos, daos fsicos o material ajeno que pudieran comprometer la calidad del polvo de arveja, fueron desechados en un recipiente alterno.

         Pesado: En una balanza se pes la cantidad requerida para el posterior procesamiento de los granos de arveja.

         Escaldado: En una marmita se sometieron los granos en agua a una temperatura de 100 C durante 90 s. Esta etapa del proceso es fundamental porque inactiva la enzima lipoxigenasa, la cual es causante de aromas y sabores indeseables caractersticos de las leguminosas. Adicionalmente, tambin se logra disminuir la carga microbiolgica de los granos.

         Enfriamiento: Luego del escaldado, se sumergieron los granos inmediatamente en agua a temperatura de 20 C durante 5 min., con la finalidad de detener el calentamiento del grano y evitar alteraciones no deseadas.

         Secado: En esta etapa se disminuy la aw de los granos en un deshidratador de acero inoxidable grado alimenticio (Model No: ST- 04(T)) a 55C durante 7 h. Posteriormente se dej enfriar a temperatura ambiente. El secado de los granos es importante porque evitar la formacin de grumos en la siguiente etapa.

         Molienda: Los granos secos se colocaron en el molino para ser triturados y posteriormente separados segn su granulometra en la siguiente etapa.

         Tamizado: Los granos triturados se tamizaron en mallas de diferentes nmeros para la obtencin del polvo de arveja con un tamao de partcula de hasta 800 um.

         Empacado: En fundas de polipropileno de alta densidad se empac y se almacen el polvo de arveja hasta su posterior uso.

 

Determinacin del contenido de protenas

Los reactivos empleados para la determinacin de protenas fueron: H2SO4 95-97 %, sulfato de cobre sulfato de potasio, NaOH 30 %, NaOH 0,1N, H2SO4 0,1N, agua destilada e indicador rojo de metilo. Dentro de los materiales se puede mencionar: Tubo Kjeldahl, perlas de vidrio, papel filtro, probeta, matraces erlenmeyer, bureta Matraz Aforado 1000ml, vasos precipitados, recipientes plsticos de 1 L, esptulas, aparato Kjeldahl, destilador de protenas, Sorbona.

El anlisis de protenas se realiz mediante el mtodo Kjeldahl determinando el contenido de nitrgeno orgnico total. El mtodo se divide en tres etapas: digestin, destilacin y valoracin.

Digestin: Se produce la descomposicin del nitrgeno contenida en la muestra usando una solucin de cido sulfrico concentrado. El resultado es sulfato de amonio.

Destilacin: Se realiza la destilacin por arrastre de vapor de agua y se libera amoniaco, el cual se retiene con cido sulfrico.

Titulacin: Mediante titulacin se determina la cantidad de amonio presente en la muestra destilada (ESPOL, 2016).

Procedimiento:

1.      Pesar aprox. 1 g de muestra en papel filtro. Realizar la muestra por duplicado.

2.      Pesar 0,8 g sulfato de cobre y 7 g de sulfato de potasio y agregar en los tubos Kjeldahl.

3.      Agregar 6 - 10 perlas de vidrio en cada tubo.

4.      Agregar las muestras envueltas en papel filtro en los tubos Kjeldahl.

5.      Llevar los tubos a la campana de extraccin y medir 25 ml de H2SO4 concentrado. Realizar un blanco (agregar todos los reactivos menos la muestra).

6.      Se coloc los tubos en la parrilla de digestin.

7.      Encender el regulador y el equipo y programar la temperatura de trabajo (Programa 4)

Paso 1: 150 C / 15 min.

Paso 2: 150 C / 15 min.

Paso 3: 300 C / 30 min.

Paso 4: 400 C / 90 min.

8.      Una vez terminado el programa, se alza el soporte de los tubos para evitar que siga el calentamiento y esperamos que se enfren.

9.      En un matraz Erlenmeyer se colocan 50 ml de cido sulfrico estandarizado al 0,1 N y se agrega 4 gotas de rojo de metilo.

10.  Los tubos son colocados uno a uno en el equipo de destilacin junto a cada matraz para recolectar el destilado.

11.  Se titula con NaOH 0,1 N; la titulacin termina cuando la solucin cambia a amarillo.

12.  Anotar el volumen consumido por la bureta.

Clculos:

El contenido de protenas en la muestra, en base seca, se calcul mediante la ecuacin 1.

Ecuacin 1:

Dnde:

P= contenido de protenas en porcentaje de masa.

= volumen de la solucin 0,1 N , empleado para recoger el destilado de la muestra, en .

= normalidad de la solucin de cido sulfrico.

= volumen de la solucin 0,1 N de NaOH, empleado en la titulacin, en .

= normalidad de la solucin de NaOH.

= volumen de la solucin 0,1 N , empleado para recoger el destilado del ensayo en blanco, en .

= volumen de la solucin 0,1 N NaOH, empleado en la titulacin del ensayo en blanco, en .

m= masa de la muestra en g.

H= porcentaje de humedad en la muestra

F= factor para convertir el nitrgeno a protenas. (F=6.25) (ESPOL, 2016)

 

Caracterizacin de aminocidos por mtodo HPLC

Para la caracterizacin de los aminocidos se emple Solucin de o-ftalaldehdo (OPA), Metanol, Tampn borato, cido mercaptopropinico, Kit de L-aminocidos de SIGMA Chemicals Corp. Equipo de HPLC Shimadzu.

La determinacin del perfil de aminocidos se realiz mediante la combinacin de la solucin de o-ftalaldehdo (OPA) con el cido mercaptopropinico produciendo un derivado isoindlico fluorescente que absorbe a 338 nm. La obtencin del derivado isoindlico fluorescente se utiliz para la deteccin de los aminocidos (Castillo et al., 2011).

Procedimiento:

1.      Preparar solucin de o-ftalaldehdo (OPA) mezclando 50 mg de OPA, 4 ml de metanol, 500 μl de tampn borato y 50 μl de cido mercaptopropinico.

2.      Mtodo de derivatizacin de la muestra: En base al procedimiento reportado por Godel (1987), utilizar la derivatizacin con OPA para los aminocidos primarios con una modificacin al reemplazar el mercaptoetanol por el cido-3-mercaptopropinico.

3.      Realizar una mezcla automtica en el inyector durante 3 min de 30 μl de muestra con 180 μl de tampn borato a pH 10,4 y 30 μl de OPA.

4.      Condiciones cromatogrficas: Uso del equipo de HPLC Shimadzu con bombas LC-10 AD VP117 y autoinyector SIL-10 AD VP con un sistema controlador SCL10 AD VP y un detector UV SPD-10A. Uso de columna: Lichrospher 100 RP18, 5 μm (Merck) con deteccin por UV a 338 nm a temperatura entre 30 y 35 C a un flujo de 1,2 ml min, con un volumen de inyeccin de 10 μl, utilizando un programa de gradiente binario. La fase mvil es un gradiente en el tiempo de los solventes A (20 mM de buffer acetato sdico con 0,018 % (v/v) de trietilamina y 0,03 % de tetrahidrofurano) y B (20 % de 100 mM de buffer acetato sdico, 40 % de acetonitrilo y 40 % de metanol).

5.      Calibracin externa: Para la cuantificacin se realiz una calibracin externa con mezcla de L-aminocidos: cido asprtico (Asp), cido glutmico (Glu), asparagina (Asn), serina (Ser), glutamina (Gln), histidina (His), glicina (Gly), threonina (Thr), alanina (Ala), arginina (Arg), tirosina (Tyr), valina (Val), metionina (Met), triptfano (Tryp), fenilalanina (Phe), leucina (Leu) y lisina (Lys), a una concentracin de 0,25 μmol/ml en 0,1 N de HCl (Castillo et al., 2011).

 

Anlisis microbiolgicos

Los insumos empleados fueron: filtro de membrana microporosa, placa estril con medio Sabouraud dextrosa agar, Tampn fosfato de pH 7,2, placa estril de agar biliar rojo violeta con glucosa y lactosa, Placa estril con medio de digestin de soja casena agar, Caldo de enriquecimiento Mossel -Enterobacteriaceae. Pinzas estriles, bomba vaca, pipetas, tubos de ensayo, equipo de filtracin.

 

Recuento microbiano aerobio total - Mtodo de filtracin por membrana

Este mtodo se fundamenta en determinar el nmero y tipo de microorganismo retenido en la superficie de un filtro de membrana microporosa con poros de 0,45 μm de dimetro para su identificacin y recuento de colonias de los microorganismos retenidos. A travs de la membrana se filtr un volumen conocido de muestra, incubada en un medio de cultivo durante un tiempo y a una temperatura adecuada (De Castro y De Curtis, 2002).

Procedimiento:

1.      Disolver 10 g de muestra en tampn fosfato de pH 7,2, medio lquido de digestin de soja - casena para hacer 100 ml.

2.      Pipetear 1 ml de la dilucin final en 5 a 10 ml de tampn fosfato de pH 7,2, medio lquido de digestin de soja casena.

3.      Lavar cada membrana con uno de los diluyentes anteriores y transferir cada membrana a una caja petri que contenga medio digerido de soja casena - agar previamente solidificado a temperatura ambiente.

4.      Incubar las placas a una temperatura de 30 a 35 C durante 48 a 72 h.

5.      Luego de la incubacin, examinar las placas en busca de crecimiento.

6.      Contar el nmero de colonias y expresar el promedio de las dos placas en trmino de nmero de microorganismos por g de muestra.

En caso de no existir colonias microbianas en las placas que representan la dilucin inicial 1:10 de la muestra, se expresar los resultados como menos de 10 microorganismos por g de muestra (Microbiology and Sterility Assurance, 2021).

 

Recuento total de mohos y levaduras - Mtodo de filtracin por membrana

Procedimiento:

Proceder con el mtodo de filtracin por membrana detallado en el procedimiento del recuento microbiano aerbico total con excepcin del medio. Se us Sabouraud dextrosa agar en lugar de medio de digestin de soja casena agar e incub las placas durante 5 a 7 das a 20 C 25 C.

 

Recuento de enterobacterias - Mtodo de mltiples tubos

Fundamento

Mediante varias diluciones sucesivas de la muestra, se busc obtener inculos de al menos una clula que presente crecimiento en el medio de cultivo. Este mtodo consta de dos fases: fase presuntiva y fase confirmativa.

En la fase presuntiva se da la fermentacin de la lactosa y en la fase confirmativa la fermentacin de lactosa y produccin de gas. La cantidad de tubos positivos y negativos permite obtener una estimacin de la densidad de bacterias obtenidas a travs de la aplicacin de clculos de probabilidad.

Procedimiento:

1.      Disolver 10 g de muestra en un volumen suficiente de tampn fosfato de pH 7,2 o medio lquido de digestin de soja - casena y diluir con medio lquido de digestin de soja - casena hasta 100 ml.

2.      Preincubar durante 2 a 5 horas a 20 C 25 C en diluyente de caldo digerido de soja y casena.

3.      Inocular cantidades adecuadas en caldo de enriquecimiento Mossel -Enterobacteriaceae para contener 0,1, 0,01, 0,001 g de producto.

4.      Incubar a 30 C 35 C durante 24 a 48 horas.

5.      Subcultivar en una placa de agar biliar rojo violeta con glucosa y lactosa e incubar a 30 C 35 C durante 18 a 24 horas.

El crecimiento de colonias bien desarrolladas, generalmente rojas o rojizas de bacterias Gramnegativas revelar la presencia de enterobacterias.

 

Anlisis estadstico

En base al supuesto de normalidad mediante la prueba Shapiro - Wilk, los datos siguieron una distribucin normal; por lo que, el anlisis estadstico se lo realiz utilizando el anlisis de varianza (ANOVA) (Tabla 2), caso contrario, se hubiera analizado mediante la Prueba no paramtrica Kruskal - Wallis. El anlisis determin si existan o no diferencias significativas entre las formulaciones, con ello se determinaba la formulacin que aportaba mayor contenido proteico. Al no existir diferencias significativas, se utiliz como factor de seleccin la media ms alta de las formulaciones para determinar aquella con mayor contenido proteico y posteriormente evaluar el perfil de aminocidos y realizar los anlisis microbiolgicos.

 

Figura 3: Tabla de anlisis de varianza para modelo de un solo factor y efectos fijos

Fuente de variacin

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Cuadrado medio

Entre los tratamientos

a-1

Error (dentro de los tratamientos)

N-a

 

Total

N-1

 

 

 

 

 

 

 

 

Anlisis de varianza para modelo de un solo factor y efectos fijos

Montgomery, 2004

a: nmero de tratamientos

N: nmero total de observaciones

n: nmero de observaciones por tratamiento

 

Prueba Kruskal Wallis

El uso de la prueba Kruskal Wallis requiere calcular el estadstico de prueba descrito por la ecuacin 2 y la varianza de rangos descrita por la ecuacin 4 para concluir sobre la distribucin de los datos en caso de no existir normalidad.

Ecuacin 2: Estadstico de prueba

Ecuacin 4: Varianza de los rangos

(Montgomery, 2004)

 

Resultados y discusin

Desarrollo de las formulaciones de las premezcla a base de avena y polvo de arvejas

Para el desarrollo de las formulaciones de la premezcla fueron realizadas con harina de avena, polvo de arveja obtenido a partir de granos de arvejas deshidratados, el espesante goma xantana para la mejora tecnolgica del producto y el sistema de preservantes NS-1017S.

Para la experimentacin de las formulaciones con los ingredientes propuestos se siguieron las etapas a continuacin: el proceso de la obtencin de la premezcla inici con el lavado de los granos mediante inmersin en una solucin de sorbato de potasio al 1 %. Los granos fueron seleccionados, aquellos que presentaban contaminacin por insectos, daos fsicos o contenan algn material ajeno que pudieran comprometer la calidad del polvo, se desechaban en un recipiente alterno y pesado.

Posteriormente, los granos se escaldaron en un recipiente metlico a una temperatura de 100 C durante 90 s para lograr la inactivacin de la enzima lipoxigenasa y reducir carga microbiolgica. Luego del escaldado, los granos fueron sumergidos inmediatamente en agua a temperatura de 20 C durante 5 min, con la finalidad de detener el calentamiento del grano y evitar alteraciones no deseadas.

Los granos secos y fros fueron deshidratados en un deshidratador de acero inoxidable grado alimenticio (Model No: ST- 04(T)) a 55C durante 7 h y se dej enfriar a temperatura ambiente. Finalmente, los granos secos fueron molidos, tamizados, mezclados con la avena y los aditivos, y empacados en fundas de polipropileno de alta densidad para evitar la contaminacin con el ambiente.

Una vez obtenido el polvo de arvejas, se procedi a realizar la mezcla con el resto de los ingredientes para la obtencin de las formulaciones.

El porcentaje de la harina de avena y el polvo de arvejas en la frmula fue definido mediante el estudio de artculos cientficos sobre la mejor combinacin entre cereales y leguminosas; y los aditivos fueron aadidos considerando la dosis de la ficha tcnica respectiva o mediante la revisin de documentos oficiales como el Codex Alimentarius o el reglamento (UE) de la Comisin Europea sobre el uso de aditivos alimentarios, esta informacin fue empleada como bases tcnicas para el desarrollo del producto.

La seleccin de ingredientes y aditivos es de gran importancia para la obtencin del suplemento, ya que esto determina la calidad del producto final. Para la elaboracin del suplemento nutricional se hizo uso de los siguientes ingredientes: - Polvo de arvejas (Pisum sativum), aporta aminocidos esenciales. Contiene altos niveles de lisina y es deficiente en triptfano y en aminocidos azufrados como metionina y cistena. - Harina de avena (Avena sativa), aporta aminocidos esenciales. Contiene altos niveles de triptfano y aminocidos azufrados como metionina y cistena.

En cuanto a los aditivos alimentarios empleados fueron: - Goma xantana, es un polisacrido (E 415) procedente de la fermentacin del maz que acta como un espesante. Confiere alta viscosidad al agregarse en preparaciones lquidas como sopas, coladas, jugos, etc. En preparaciones como salsas, lcteos como helados, productos de panadera y pastelera, se lo puede usar como estabilizante o emulsionante. -Preservantes (NS-1017S), es un sistema de preservantes efectivo contra bacterias, mohos y levaduras, en un rango de pH de 5,0 a 6,5. Los componentes qumicos que componen el sistema son: propionato de sodio, sorbato de potasio, acetato de calcio. Cada uno de estos componentes tiene un rango ptimo de pH as como el tipo de microorganismos contra los cuales son efectivos. Ello propicia una mayor estabilidad del alimento e incrementar su vida til del producto.

Se desarrollaron tres formulaciones. La primera formulacin contena 60% avena 40% arveja, la segunda formulacin 50% avena 50% arveja y la tercera formulacin 40% avena 60% arveja. El porcentaje de los aditivos se mantuvo constante ya que estos no tenan influencia en el contenido final de protenas de la premezcla y por ende en la concentracin final de los aminocidos, obteniendo as los prototipos de estudio.

Para la seleccin de la mejor formulacin, que se ajuste al concepto del producto planteado en la presente investigacin, se analiz el contenido de protenas con ayuda de un diseo completamente aleatorizado (DCA), el cual tena como objetivo analizar el efecto de las combinaciones avena: arveja en el contenido total de protenas. La aplicacin del diseo experimental se realiz considerando un factor, tres tratamientos y 5 repeticiones. El factor era la proporcin avena: arveja, los tratamientos eran las formulaciones y las repeticiones el nmero de anlisis de protenas que se iba a realizar por tratamiento.

Finalmente, se analiz el perfil de aminocidos a la formulacin seleccionada del diseo experimental para su posterior comparacin con el perfil de aminocidos propuesto por la FNB/IOM y la FAO a diferentes grupos etarios. De esta manera, se determin el segmento de poblacin que poda consumir la premezcla y se valida el planteamiento de la formulacin que se ajustaba al eje central de la investigacin.

 

Determinacin del contenido de protenas de las formulaciones mediante mtodo Kjeldhal

Las tres formulaciones planteadas fueron analizadas utilizando muestras de aproximadamente 200 g en condiciones climticas de ensayo de 22,5 C 2,5 C de temperatura y 55 % 15 % de humedad relativa. La Tabla 3 indica los porcentajes de protena de las tres formulaciones con cinco repeticiones por formulacin.

 

Figura 4: Cantidad de protenas de las tres formulaciones

Tratamientos

Formulacin 1

Formulacin 2

Formulacin 3

% Protena

13,96

13,40

13,37

13,48

13,67

14,00

13,29

13,16

13,05

13,44

13,35

13,12

13,00

13,18

13,17

Promedio

13,43

13,35

13,34

 

Porcentaje del contenido de protenas

El porcentaje de protena de las tres formulaciones se encuentra en un rango de 13 14 %. En el diseo experimental, los valores de cada formulacin ayudarn a determinar si variar el porcentaje de avena y arveja influye significativamente en el contenido de protenas entre las formulaciones.

 

Resultados del diseo experimental

Prueba de normalidad: Shapiro Wilk

La Tabla 4 muestra el resultado de la prueba de normalidad para las tres formulaciones. El valor de significancia es mayor a 0,05, por lo tanto, no se rechaza la hiptesis nula. Es decir, las tres formulaciones siguen una distribucin normal. Las Figuras 2, 3 y 4 muestran el test de normalidad de las formulaciones.

 

Figura 5: Test de normalidad de las tres formulaciones

 

Tratamiento

Nmero de repeticiones

Valor de significancia

Contenido de protena

1

5

0,798

2

5

0,437

3

5

0,082

 

Valor α= 0,05

Formulacin 1

 

Figura 6: Test de normalidad para la formulacin 1

 

Formulacin 2

 

Figura 7: Test de normalidad para la formulacin 2

 

Formulacin 3

 

Figura 8: Test de normalidad para la formulacin 3

 

Diseo completamente aleatorizado (DCA)

En la Tabla 5 se puede observar que el valor de significancia es mayor a 0,05, por lo tanto, se acepta la hiptesis nula. No hay diferencias significativas entre las tres formulaciones, es decir, se puede escoger cualquiera de las tres formulaciones para realizar el anlisis del perfil de aminocidos y microbiolgico segn los objetivos planteados.

 

Figura 8: Anlisis de las tres formulaciones

Variable dependiente

Contenido de Protena

Fuente

Tipo III. Suma de cuadrados

df

Media cuadrtica

F

Sig.

Tratamiento

0,025

2

0,013

0,122

0,886

 

Valor de significancia de los tratamientos

Es decir que estadsticamente con la cantidad de datos analizados (15 datos) no se pudo demostrar que hay diferencias significativas. Por lo tanto, se considera la media de las formulaciones como un indicador para la seleccin del tratamiento con el mayor contenido de protenas y con ello realizar el anlisis del perfil de aminocidos.

En la Tabla 6 se muestra los valores de la media de cada formulacin.

 

Figura 9: Media de las tres formulaciones

Tratamientos

Variable dependiente:

Contenido de protena

Tratamiento

Media

1

13,434

2

13,352

3

13,342

 

Media del contenido de protena de las tres formulaciones

Para analizar el perfil de aminocidos se seleccion la formulacin 1 dado que la media es levemente ms alta en comparacin a la media de la formulacin 2 y la formulacin 3 como se observa en la tabla.

Determinacin del perfil de aminocidos de la formulacin seleccionada

El perfil de aminocidos de la formulacin 1 fue analizado por el laboratorio analtico UBA acreditado. Los resultados fueron presentados en unidades de g aminocido / 100 g muestra (g AA / 100 g) como se detalla en la Tabla 7.

 

Figura 10: Perfil de aminocidos esenciales y no esenciales de la formulacin 1

Perfil de aminocidos

Parmetros

Resultados

Unidad

cido Asprtico

1,08

g AA/100 g muestra

Base hmeda (p/p)

cido Glutmico

2,3

Serina

0,58

Histidina

0,30

Treonina

0,44

Glicina

0,42

Arginina

0,91

Alanina

0,56

Tirosina

0,52

Valina

0,57

Triptfano

1,27

Metionina

0,19

Fenilalanina

0,60

Isoleucina

0,45

Leucina

0,86

Lisina

0,76

Cistena

0,29

Aminocidos totales

12,1 p/p

 

 

Perfil de aminocidos de la formulacin con mayor contenido de protenas

La Tabla 7 indica que la formulacin 1 contiene mayor cantidad de cido glutmico y triptfano, y menor cantidad de metionina.

 

Comparacin del perfil de aminocidos de la formulacin seleccionada con el perfil de aminocidos dado por la FNB/IOM y FAO

La Tabla 8 detalla el perfil de aminocidos esenciales de la formulacin 1, el perfil de aminocidos descrito por el Comit de Alimentacin y Nutricin del Instituto Americano de Medicina (FNB/IOM) para nios de 1 a 3 aos y el perfil de aminocidos descrito por la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO) para nios lactantes, mayores de 3 aos, adolescentes y adultos.

 

Figura 11: Perfil de aminocidos esenciales de la formulacin 1

Perfil de aminocidos esenciales

Parmetros

Resultados Formulacin 1

FAO

FAO

FNB/IOM

FAO

Lactantes (Recin nacido hasta 6 meses)

Nios de 6 meses a 3 aos

Nios de 1 a 3 aos

Nios mayores, adolescentes, adultos

g AA/100 g muestra

mg AA/g protena

mg AA/g protena

Histidina

0,30

22,33

21

20

18

16

Isoleucina

0,45

33,49

55

32

25

30

Leucina

0,86

64,02

96

66

55

61

Lisina

0,76

56,57

69

57

51

48

Metionina + Cistena

0,48

35,73

33

27

25

23

Fenilalanina + Tirosina

1,12

83,37

94

52

47

41

Treonina

0,44

32,75

44

31

27

25

Triptfano

1,27

94,54

17

8,5

7

6.6

Valina

0,57

42,43

55

43

32

40

Cumple/No cumple

No cumple

No cumple

Cumple

Cumple

Aminocidos esenciales de la protena de la formulacin 1

Young y Pellett, 1990; Millward et al., 1990; FAO/WHO/UNU, 1985; FNB/IOM, 2002.

FAO, 2011

 

El perfil de aminocidos de la formulacin 1 fue transformado de g AA/100 g muestra a mg AA/g protena mediante la conversin de unidades para la comparacin con los niveles de aminocidos descritos por la FNB/IOM y la FAO. A continuacin, la ecuacin 3 detalla el procedimiento del clculo de mg AA/g protena a partir de g AA/100 g muestra considerando como ejemplo el aminocido histidina.

Contenido de protenas de la formulacin 1:

Aminocido histidina:

Ecuacin 3:

 

La comparacin del perfil de aminocidos de la formulacin seleccionada con el perfil de aminocidos detallado por la FAO y la FNB/IOM, indican que esta premezcla cumple con los requisitos mnimos de aminocidos para ser consumido por nios mayores a 1 ao, adolescentes y adultos; pero no es apto para ser consumido por lactantes (< 6 meses) ni para nios menores a 1 ao (6 meses a 1 ao).

 

Anlisis microbiolgicos de la formulacin seleccionada segn la Norma Tcnica Ecuatoriana INEN 2983

La Tabla 9 compara los resultados de los anlisis microbiolgicos realizados a la formulacin 1 con los requisitos microbiolgicos estipulados en la norma NTE INEN 2983 para complementos nutricionales Tipo II (Complementos nutricionales que contienen ingredientes botnicos extractos/ otros ingredientes nutricionales).

 

Figura 12: Anlisis microbiolgicos de la formulacin 1

Anlisis microbiolgicos

Requisito

Unidad

Resultado

Requisito Tipo II

Cumple/No cumple

Aerobios totales, mx.

UFC/g

Cumple

Mohos y levaduras, mx.

UFC/g

Cumple

Enterobacterias, mx.

UFC/g

Cumple

Salmonella

-

ND

ND

Cumple

Escherichia coli

-

ND

ND

Cumple

Staphylococcus aureus

-

ND

ND

Cumple

Comparacin de los anlisis microbiolgicos de la formulacin seleccionada con los requisitos estipulados en la norma NTE INEN 2983.

 

La formulacin 1 cumple con todos los requisitos microbiolgicos para complementos nutricionales Tipo II estipulados en la norma NTE INEN 2983.

 

Discusin

El cumplimiento de las etapas para el desarrollo de la formulacin del suplemento result crucial para obtener un producto final de buena calidad y con las caractersticas deseadas. Tal como lo menciona Cmpora (2016) la generacin de conocimiento y de tecnologas orientadas al desarrollo de los productos, a su diferenciacin en el mercado y a su valorizacin, resultan elementos fundamentales en la generacin de propuestas de alimentos que respondan a necesidades concretas de la poblacin. No solo con el objetivo de responder a las demandas de la cadena de valor y de la calidad implcita esperada por los consumidores sino tambin para contribuir en propuestas con mayor competitividad en los sectores agroindustriales.

El elemento de mayor repercusin en el desarrollo de productos se fundamenta en la implementacin de tcnicas de calidad, que junto a la innovacin permiten alcanzar los objetivos planteados ya sea de investigacin o de recursos econmicos deseados con un nuevo producto a nivel empresarial. Segn lo indica Zapata-Gmez (2013) ese alcance de la calidad en el diseo de una formulacin implica la integracin de conocimientos que contribuyen a establecer las bases de una estructura que puede ser llevada a un campo productivo otorgando estrategias para mantenerse en el mercado. Estos elementos en la formulacin de productos, han sido tomados en cuanta para el desarrollo del suplemente detallado en la presente investigacin.

Los resultados del contenido de protenas de la premezcla a base de avena y polvo de arveja (cereal y leguminosa) concuerdan con la investigacin realizada por el autor Santilln (2018), el cul desarroll mezclas alimenticias a base de cuatro cereales y cuatro leguminosas con el fin de obtener la combinacin de mejor calidad aminoacdica (lisina, metionina, cistena, treonina, triptfano, histidina). Los cereales utilizados fueron el arroz (Oryza sativa), el trigo (Triticum aestivum), la avena (Avena sativa) y el maz (Zea mays); y las leguminosas utilizadas fueron el chocho (Lupinus mutabilis), la arveja (Pisum sativum), la lenteja (Lens culinaris), y el frijol (Phaseolus vulgaris). De 144 mezclas alimenticias 99 tenan la calidad biolgica deseada. Adicionalmente, obtuvo como resultado que las mezclas con mayor proporcin de cereal (mezclas cereales:leguminosas 2:1) presentaban valores ms altos de aminocidos. Por lo tanto, se comprueba que la mezcla de un cereal ms una leguminosa forma protenas de alto valor biolgico y se confirma que los resultados obtenidos del diseo experimental fueron los correctos, dado que para realizar el anlisis del perfil de aminocidos se seleccion la formulacin con mayor valor proteico segn las medias obtenidas y cuya proporcin de cereal result tambin ser mayor segn las formulaciones planteadas. Por otra parte, los autores Fernndez y Guivar (2016) determinaron el contenido proteico y el aporte energtico de una formulacin a base de dos leguminosas y un cereal (arveja, tarwi y kiwicha), obteniendo como resultado que la formulacin con 25 % de arveja, 25 % de tarwi y 50 % de kiwicha (amaranto) tiene un mayor contenido proteico donde el 65% corresponde a la kiwicha. Una vez ms, se reafirma que el cereal brinda mayor contenido de protenas y por tanto mayor proporcin de aminocidos en una mezcla que tambin contenga leguminosas.

El valor biolgico de una protena (para satisfacer las necesidades de aminocidos) es determinado por su disponibilidad en el alimento y por la correccin de digestibilidad de cada aminocido, es decir, la proporcin absorbida del aminocido consumido. El alcance de esta investigacin se limita al anlisis de la disponibilidad de aminocidos en el alimento, considerando como fuente principal de verificacin el perfil de aminocidos dado por el Comit de Alimentacin y Nutricin del Instituto Americano de Medicina (FNB/IOM) y la Organizacin de las Naciones Unidas para la Agricultura y la Alimentacin (FAO). Estos organismos internacionales detallan los valores mnimos requeridos de cada aminocido para diferentes grupos etarios.

El perfil de aminocidos de la premezcla a base de harina de avena y polvo de arvejas cumpli con todos los valores detallados en las tablas de la FNB/IOM y la FAO exceptuando a los indicados para lactantes. En este caso, los lactantes se consideran como un grupo especial, dado que los valores de los aminocidos detallados en las tablas de la FNB/IOM y la FAO estn basados en el contenido bruto de aminocidos de la protena de la leche humana, ya que son la mejor estimacin de requerimientos para este grupo de edad.

La FNB/IOM y la FAO recomiendan realizar la estimacin de la cantidad de cada aminocido que puede ser absorbida por el tracto digestivo (la digestibilidad de cada aminocido) para obtener un mejor enfoque de la protena o de la combinacin de protenas de un alimento.

Finalmente, es importe mencionar que la mezcla propuesta cumple con los requisitos microbiolgicos segn lo indicado en la normativa de referencia Norma Tcnica Sanitaria 071-MINSA/DIGESA V-01 (2008).

 

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