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Caracterizaci�n microbiol�gica de agua para consumo humano procedente de vertientes subterr�neas en la comunidad de Azactus, Cant�n Chambo, Provincia de Chimborazo

 

Microbiological characterization of water for human consumption from underground springs in the community of Azactus, Chambo Canton, Chimborazo Province

 

Caracteriza��o microbiol�gica da �gua para consumo humano de nascentes subterr�neas na comunidade de Azactus, cant�o de Chambo, prov�ncia de Chimborazo

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Correspondencia: mishell.moreno@espoch.edu.ec

 

 

Ciencias T�cnicas y Aplicadas ���

Art�culo de Investigaci�n

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* Recibido: 23 de mayo de 2022 *Aceptado: 12 de junio de 2022 * Publicado: 26 de julio de 2022

 

       I.          Mgs. en Biolog�a Celular y Molecular, Advanced Materials Research Group (GIMA), Docente investigador, Facultad de Ciencias, Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.

      II.          Investigador independiente, Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador.

    III.          Investigador independiente, Escuela Superior Polit�cnica de Chimborazo, Riobamba, Ecuador

    IV.          PhD Materials Science, Advanced Materials Research Group (GIMA), Docente investigador, Escuela de Ciencias Biol�gicas e Ingenier�a, Universidad Yachay Tech, Urcuqu�, Ecuador.

Resumen

La comunidad Azactus cuenta con un acueducto comunitario, el cual dota de agua a la mencionada poblaci�n por acci�n de gravedad, no obstante, esta no pasa por ning�n proceso de tratamiento para mejorar sus condiciones. Esta investigaci�n tuvo como objetivo caracterizar el microbiota del agua de vertiente de la comunidad Azactus del cant�n Chambo de la provincia de Chimborazo. Se realiz� un muestreo de agua al azar, por duplicado, posteriormente, se inocularon muestras simples de agua para realizar un recuento de colonias para caracterizarlas morfol�gicamente y someterlas a pruebas bioqu�micas (catalasa, oxidasa, ureasa, citrato, entre otras) con el objetivo de determinar el g�nero y la especie bacteriana. Se obtuvieron 12 bacilos gram negativos (48%) y 13 cocos gram positivos (52%). Se identific� la posible presencia de S. epidermis, S. auereus, P. aureginosa, P. putida y Aeromonas spp; as� mismo, se identificaron morfotipos f�ngicos en el agua de vertiente como: Rhodotorula aurantiaca, Cryptoccocus laurentis, Penicillium spp. y Basipetospora spp; las bacterias gram positivas resultaron sensibles hacia la vancomicina, ceftriaxona y ciproflaxacino; y resistentes a la penicilina y la ampicilina. Mientras que, las bacterias gram negativas resultaron sensibles hacia ciproflaxacino, kanamicina, eritromicina, gentamicina; y resistentes a ampicilina y amoxicilina. Las colonias puras encontradas demostraron que pueden ser resistentes hacia varios de los antimicrobianos usados en la investigaci�n.

Palabras Clave: Antibi�tico; Pruebas Qu�micas; Resistencia Bacteriana; Vertiente; Microbiota.

 

Abstract

The Azactus community has a community aqueduct, which provides water to the aforementioned population by gravity, however, it does not go through any treatment process to improve its conditions. The objective of this research was to characterize the microbiota of the spring water of the Azactus community of the Chambo canton of the Chimborazo province. A random water sampling was carried out, in duplicate, later, simple water samples were inoculated to perform a count of colonies to characterize them morphologically and subject them to biochemical tests (catalase, oxidase, urease, citrate, among others) with the objective of determine the genus and species of bacteria. 12 gram negative rods (48%) and 13 gram positive cocci (52%) were obtained. The possible presence of S. epidermis, S. aureus, P. aureginosa, P. putida and Aeromonas spp was identified; likewise, fungal morphotypes were identified in the spring water such as: Rhodotorula aurantiaca, Cryptoccocus laurentis, Penicillium spp. and Basipetospora spp; Gram-positive bacteria were sensitive to vancomycin, ceftriaxone, and ciproflaxacin; and resistant to penicillin and ampicillin. While gram negative bacteria were sensitive to ciproflaxacin, kanamycin, erythromycin, gentamicin; and resistant to ampicillin and amoxicillin. The pure colonies found showed that they can be resistant to several of the antimicrobials used in the research.

Keywords: Antibiotic; Chemical Tests; Bacterial resistance; Slope; microbiota.

 

Resumo

A comunidade Azactus possui um aqueduto comunit�rio, que fornece �gua para a referida popula��o por gravidade, por�m, n�o passa por nenhum processo de tratamento para melhorar suas condi��es. O objetivo desta pesquisa foi caracterizar a microbiota da �gua de nascente da comunidade Azactus do cant�o Chambo da prov�ncia de Chimborazo. Realizou-se uma amostragem aleat�ria de �gua, em duplicata, posteriormente inocularam-se amostras simples de �gua para realizar uma contagem de col�nias para caracteriz�-las morfologicamente e submet�-las a testes bioqu�micos (catalase, oxidase, urease, citrato, entre outros) com o objetivo de determinar o g�nero e a esp�cie de bact�rias. Foram obtidos bastonetes de 12 gramas negativos (48%) e cocos de 13 gramas positivos (52%). Foi identificada a poss�vel presen�a de S. epidermis, S. aureus, P. aureginosa, P. putida e Aeromonas spp; da mesma forma, foram identificados morfotipos f�ngicos na �gua de nascente como: Rhodotorula aurantiaca, Cryptoccocus laurentis, Penicillium spp. e Basipetospora spp; As bact�rias Gram-positivas foram sens�veis � vancomicina, ceftriaxona e ciproflaxacina; e resistente � penicilina e ampicilina. Enquanto as bact�rias gram negativas foram sens�veis � ciproflaxacina, canamicina, eritromicina, gentamicina; e resistente � ampicilina e amoxicilina. As col�nias puras encontradas mostraram que podem ser resistentes a v�rios dos antimicrobianos utilizados na pesquisa.

Palavras-chave: Antibi�tico; Testes Qu�micos; Resist�ncia bacteriana; Declive; microbiota.

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Introducci�n

Debido al mal uso de los antibi�ticos, las bacterias han desarrollado una resistencia adquirida, generalmente causada por la modificaci�n de sus genes y por la selecci�n de mutantes resistentes.

Seg�n las estad�sticas, se conoce que en Ecuador existe un �ndice de morbilidad entre el 9 y el 14% debido a patolog�as causadas por ingesti�n de agua contaminada, fuente de consumo diario en la poblaci�n¹. Es por ello por lo que, en los �ltimos a�os, las exigencias higi�nicas son m�s rigurosas si una fuente acu�tica se desea destinar al consumo humano. En el pa�s, el SNAP ha implementado programas de protecci�n de las fuentes h�dricas, de modo que se pueda garantizar la cantidad y calidad de estas para su posterior uso por las comunidades m�s pobladas².

En el caso de la comunidad Azactus, ubicada en el cant�n Chambo, la captaci�n del agua se limita a la entubaci�n desde su origen, sin embargo, la comunidad para lograr potabilizar el agua utiliza una peque�a pastilla como m�todo de cloraci�n.

En base a lo anterior, la presente investigaci�n permiti� caracterizar microbiol�gicamente el agua de la vertiente subterr�nea de la comunidad Azactus. Se identific� la presencia de microorganismos pat�genos potencialmente peligrosos para la salud humana su prevalencia y su capacidad de resistencia, para finalmente poder compararlos con los l�mites permisibles establecidos en la normativa vigente ecuatoriana.

La importancia del estudio tambi�n radica en que se aport� con datos de la calidad del agua que permitir�n promover mayor seguridad de ingesta de esta o, a su vez, permita a los gobiernos y a la comunidad la toma de medidas para la gesti�n de la contaminaci�n y la recuperaci�n de la calidad del agua de la vertiente.

 

Materiales y m�todos/metodolog�a

Este estudio se aplic� en la comunidad de Azactus; en la figura 1 se muestra la referenciaci�n geogr�fica del lugar de estudio.

 

 

Figura 1: Localizaci�n geogr�fica

 

Para llevar a cabo la ejecuci�n de este proyecto, el trabajo se distribuy� en tres fases; fase I-Visita de reconocimiento del �rea de estudio, y muestreo, fase II-An�lisis de laboratorio y fase III-Tratamiento y an�lisis de los resultados; a continuaci�n, se describen cada una de ellas.

 

Fase I: Reconocimiento del �rea de estudio

En la selecci�n de los puntos de muestreo�� desde la captaci�n hasta la distribuci�n del agua en la comunidad de Azactus, los sitios fueron georreferenciados como punto de monitoreo para la recolecci�n de muestras de acuerdo con los protocolos determinados por la norma INEN 1105 C y la norma INEN 1108^3,4. Las muestras tomadas fueron tres, etiquetadas como P1, P2 y P3.

 

Fase II: An�lisis de laboratorio

Una vez terminado cada muestreo se realizaron los an�lisis de laboratorio microbiol�gico correspondientes.

Para la caracterizaci�n previa Se seleccionaron medios de cultivo aptos para el crecimiento bacteriano mixto como agar nutritivo y agar sangre para el crecimiento de microorganismos aerobios estrictos.

Se usaron medios selectivos como agar McConkey, MBE y el medio Muller Hilton para las pruebas de resistencia a los antimicrobianos. La siembra de las muestras de agua se realiz� mediante diluciones seriadas (base 10) hasta 10-8 en agua de peptona.

An�lisis microbiano: Se realiz� en una superficie plana en Placas 3M Petrifilm TM espec�fico para E. coli y coliformes, Staphylococcus aureus, mohos y levaduras⁵.

 

Fase III: Caracterizaci�n

Estabilizaci�n: Mediante la t�cnica de aislamiento por agotamiento, se realizaron cuatro repiques sucesivos, con el fin de obtener cepas estabilizadas.

Caracterizaci�n macrosc�pica: se realiz� una observaci�n directa de las caracter�sticas f�sicas que presentaban las colonias aisladas por la t�cnica de agotamiento, considerando principalmente el color, borde, tama�o y forma de las colonias.

Caracterizaci�n microsc�pica: utiliz� la Tinci�n Gram, para facilitar la observaci�n de las bacterias, y permitir diferenciar los grupos Gram positivas y Gram negativas.

 

Pruebas bioqu�micas de identificaci�n bacteriana: Se llev� a cabo las pruebas de Oxidasa, Citrato, Ureasa, Medio SIM, Producci�n de H2S y la Prueba de Indol.

 

Identificaci�n de bacterias Gram negativas: Se realizaron en Agar MacConkey, Agar E.M.B

 

Evaluaci�n de resistencia bacteriana: La resistencia se evalu� con respecto a los siguientes antibi�ticos: gentamicina; amikacina; ceftriaxona; ciprofloxacina; penicilina; tetraciclina; ampicilina; vancomicina; amoxicilina; trimetoprima /sulfametoxazol; kanamicina; eritromicina; tetraciclina; nitrofurantoina; gentamicina⁶.

 

Materiales y equipos: Los materiales y equipos utilizados se detallan en la tabla 1.

 

Tabla 1: Materiales y equipos utilizados

 

 

Resultados y discusi�n

Los resultados reflejan que existe un crecimiento bacteriano moderado en las muestras en los puntos de muestreo, tal como lo indica la Figura 2, en el primer punto de muestreo (P1) y el tercer punto de muestreo (P3) es donde existe el mayor crecimiento con un total de 49 UFC halladas, mientras que el segundo punto de muestreo (P2) obtuvo 18 UFC.

Figura 2: Colonias bacterianas

 

Tal como lo indica el Acuerdo Ministerial 097 anexo I, no se evidenci� la presencia de Escherichia Coli, lo que indica que el agua de la vertiente no presenta contaminaci�n fecal. Por otro lado, la Norma Ecuatoriana INEN 1108 establece que, en el agua no se debe evidenciar la presencia de Coliformes fecales ni Coliformes totales, por lo tanto, seg�n esta normativa, la calidad del agua proveniente de la vertiente es de buena calidad y apta para el consumo humano⁷.

Se evidencia crecimiento bacteriano del g�nero Staphylococcus, sin embargo, este no es significativo, ya que se encontr� 9 UFC/ml en las muestras del agua que se distribuye a la comunidad de Azactus. No obstante, la OMS establece que debe existir una ausencia total de este tipo de microorganismos.

Se estim� una cantidad elevada de mohos y levaduras como se muestra en la Figura 3, llegando a observar 34UFC y 160UFC, respectivamente. Seg�n la Norma Uruguaya⁸, el recuento de mohos y levaduras no debe sobrepasar los 100 UFC (INTN, 2011); sin embargo, seg�n la Normativa de la Rep�blica de Venezuela, el recuento de mohos y levaduras no debe sobrepasar las 500 UFC/ml. Estos resultados obtenidos tambi�n concuerdan con un estudio realizado por Ibarra (2017) en el mismo territorio, en la cual se muestra un mayor crecimiento bacteriano en el tanque de captaci�n y un menor crecimiento bacteriano en la red de distribuci�n. Seg�n los est�ndares europeos, para el n�mero de colonias cultivadas a 37�C se establece un valor l�mite de 20 UFC/ml. Sin embargo, en la investigaci�n se obtuvo un valor de 116 UFC/ml, siendo este par�metro mucho mayor al establecido en los l�mites permisibles⁸.

 

 

 

 

 

 

Figura 3: Mohos y levaduras identificadas

 

Respecto a la caracterizaci�n macrosc�pica de bacterias, se obtuvo que el 24% de las colonias aisladas presentan una coloraci�n blanca, el 64% presenta una coloraci�n amarilla y el 12% presenta una coloraci�n amarillo-verdosa. Por su tama�o, el 36% de las colonias bacterianas presentan un tama�o de 1 mm, mientras que el 64% tienen un tama�o de 0.5 mm. Por su forma, el 60% presenta forma circular y el 40% es irregular. Sus bordes se definieron con el 45% entero, 20% onduladas y 35 % lobuladas. Seg�n su consistencia, se observ� que el 88% son cremosas y el 12% viscosas. De la misma manera, las colonias bacterianas seg�n la elevaci�n constan del 40% elevadas y un 60% planas; la superficie que presentan las colonias consta de 60% lisa y el 40% rugosa, en la luz reflejada el 20% mate y el 80% brillante y en luz transmitida se obtuvo el 36% opaca y 64% transl�cida

En la caracterizaci�n macrosc�pica de levaduras se identific� que el 100% de las levaduras aisladas presentan una coloraci�n blanquecina, el 50% es de forma circular y el restante de forma ovoide. �El borde de todos los aislados se identifican como enteros? y su consistencia cremosa. Adem�s, el 50 % de los aislados presentan una elevaci�n convexa y el restante elevada. Por �ltimo, la mitad de los aislados tienen una superficie serosa y la otra mitad presenta superficie lisa.

Respecto a la caracterizaci�n macrosc�pica de mohos, se evidenci� que el 75% de los aislados presentan una coloraci�n blanca, y tan solo el 25% presenta una coloraci�n verde. El 100% de los aislados presentan forma circular, borde entero, consistencia esponjosa, elevada y una superficie rugosa. Estas caracter�sticas concuerdan con las identificadas por Mosto (1995) en sistemas de distribuci�n de agua potable⁹.

 

En la caracterizaci�n microsc�pica por medio de la Tinci�n Gram, se obtuvieron 13 bacilos Gram negativos y 12 cocos Gram positivos; por otro lado, el 52% de las colonias bacterianas pertenecieron al grupo Gram positivos y un 48% de Gram negativos.

En cuanto a los resultados para los morfotipos f�ngicos aislados del agua de vertiente, se puede presenciar que las levaduras que presentan formas esf�ricas, ovoides a elongadas, algunas solitarias, de a pares, o en cadenas cortas. Sin embargo, se podr�a mencionar que se evidencia el desarrollo de pseudomicelio primitivo o robusto en las muestras que se analizaron. Para el caso de los mohos se identifica un conidi�foro erecto, simple, semejante a las hifas. Conidios (artroporas) hialinos, unicelulares, globosos a cil�ndricos, en cadenas basales. Tambi�n se identifica un conidi�foro erecto, simple, semejante a las hifas. Conidios (artroporas) hialinos, unicelulares, globosos a cilindricos, en cadenas basales.

En la evaluaci�n bioqu�mica de las colonias bacterianas previamente aisladas, los resultados de las pruebas inmediatas arrojaron que el 80% de los aislamientos son positivos y el 20% son negativos para la producci�n de la enzima catalasa, para ello se evidenci� la presencia de burbujas de ox�geno en el medio⁷. Para la prueba de oxidasa, el 50% son negativos, y el 50% son positivos para la producci�n de la enzima citocromo c oxidasa. Estas pruebas se utilizaron debido a la accesibilidad e implementaci�n en el laboratorio¹⁰.

Figura 4: Evaluaci�n bioqu�mica

 

Por otro lado, para los cultivos realizados en el agar base urea Christensen, se evidenci� que el 24% de los aislamientos sufrieron un cambio de color, dando como positivo en la producci�n de la enzima ureasa, mientras que, para la prueba de citrato, tan solo en un 8% de las colonias bacterianas se presenci� el cambio a una coloraci�n azul. Para la prueba con agar Macconkey, el 28% de las colonias presentaron color rojo, por tal raz�n, son capaces de fermentar la lactosa¹¹. En la prueba de Kliger, el 52% de los aislados fueron positivos, y se obtuvo que el 20% es capaz de fermentar la lactosa; el 10% puede fermentar la lactosa y la glucosa, el 25% fermenta la lactosa sin producci�n de gas y el 5% fermenta la glucosa sin la producci�n de gas. Tambi�n, para la prueba de manitol, solo el 20% dio positivo y el 80% de los aislados no presenta esta capacidad. As� mismo, mediante la prueba SIM se logr� determinar que el 72% de las colonias presentan la capacidad de ser m�tiles.

 

Tabla 2: Pruebas bioqu�micas usadas en las colonias bacterianas.

 

 

 

 

 

 

Se logr� determinar las especies de bacterias presentes en las 25 colonias bacterianas aisladas como se muestra en la Tabla 2, identificando como la de mayor incidencia a S. aureus (32%), esta cepa presenta catalasa (+), coagulasa (+), oxidasa (-), manitol (+), pero para la prueba de kigler no fermenta glucosa sino lactosa ⁴. Por otro lado, P. aureginosa (28%) report� oxidasa (+), catalasa (+), ureasa (+), indol (-), y en prueba de Kigler se obtiene la fermentaci�n de glucosa sin la producci�n de gas^4,9. Por su lado, Staphylococcus epidermis (20%) present� catalasa (+), coagulasa (-), ureasa (+), adem�s es capaz de fermentar tanto glucosa como lactosa³. P. putida (12%) presenta oxidasa (+), catalasa (+), ureasa (-), indol (-) y en la prueba de kigler fermenta la glucosa, pero no la lactosa. Finalmente, Aeromonas spp (8%) mostr� catalasa (+), oxidasa (+), ureasa (-), citrato (-), en la prueba de SIM muestra: indol (+), sulfuro (-) y motilidad (+).

Se observaron varias cepas f�ngicas aisladas que se visualizan en la Figura 5. A partir del agua de vertiente, entre las cuales tenemos las siguientes especies: Rhodotorula aurantiaca (33%), Cryptoccocus laurentis (33%), Penicillium spp (22%) y Basipetospora spp (11%).

 

Figura 5: Especies f�ngicas presentes en el agua de vertiente

 

Los an�lisis de la resistencia de bacterias Gram positivas mostraron los resultados reflejados en la Tabla 3:

 

Tabla 3: Resistencia de bacterias Gram positivas

Nota: GEN (Gentamicina), AMIK (Amikacina), CEF (Ceftriaxona), CIPRO (Ciproflaxacino), PEN (Penicilina), TETRA (Tetraciclina), AMP �(Ampicilina), VAN (Vancomicina), AMOX (Amoxicilina).

 

En la Tabla 3 se evidencia que S. epidermis presenta resistencia a PEN y AMP, ya que sus halos de inhibici�n se encuentran entre 0-6 mm como se observa en la Figura 5. Sin embargo, S. aureus presenta multirresistencia, ya que muestra un halo de inhibici�n de entre 0 a 6 mm cuando es cultivado en presencia de antibi�ticos como GEN, TETRA, AMOX Y PEN. De esto, se puede deducir que el 23% presentan resistencia a un antibi�tico, el 39% es resistente al menos a 2 antibi�ticos, el 23% presentan multi resistencia al menos a 3 antibi�ticos y el 15% presentaron sensibilidad a todos los antimicrobianos.

Los an�lisis de la resistencia de bacterias Gram negativas mostraron los siguientes resultados detallados en la Tabla 4:

 

Tabla 4: Resistencia de bacterias Gram negativas

 

 

 

 

 

 

 

 

Nota: GEN (Gentamicina), AMIK (Amikacina), CEF (Ceftriaxona), CIPRO (Ciproflaxacino), PEN (Penicilina), TETRA (Tetraciclina), AMP (Ampicilina), VAN (Vancomicina), AMOX (Amoxicilina).

 

 

 

 

 

 

 

Figura 6: Evaluaci�n de la resistencia a antibi�ticos

 

En la tabla 4, se puede observar el efecto de los antibi�ticos CIPRO, AMP, KAN, ERI, TETRA, TRIME, GEN y AMOX en las colonias bacterianas de P. aeruginosa, P. putida y Aeromonas spp., en el medio Muller Hilton. P. aeruginosa muestra ser una bacteria multirresistente, ya que crece en presencia del antibi�tico mostrando un halo de inhibici�n de entre 0 a 8 mm cuando es cultivado en presencia de 6 antibi�ticos como son GEN, TETRA, AMOX, TRIME, CIPRO, AMP. Sin embargo P. putida muestra solamente resistencia a dos antibi�ticos siendo estos AMO y AMOX. Para el caso de Aeromona spp., tambi�n se obtiene un car�cter multirresistente, porque esta cepa crece de manera eficaz antes los antibi�ticos CIPRO, AMP y AMOX mostrando halos de inhibici�n de 0- 8 mm.

 

Conclusiones

La evaluaci�n microbiol�gica (coliformes totales y fecales /E. coli, mohos y levaduras, y Staphylococcus) mostr� que no existe presencia de coliformes en las muestras de agua, pero existe un bajo crecimiento de Staphylococcus indicando que la calidad del agua de esta presenta m�nima contaminaci�n.

En la evaluaci�n de la resistencia a antibi�ticos, por parte de las colonias bacterianas Gram positivas se identifica que el 23% presenta resistencia al menos a un antibi�tico, el 39% presenta resistencia a dos antibi�ticos, el 23% de las colonias presentan multirresistencia a 3 de los antibi�ticos usados y tan solo el 15% de las colonias presenta sensibilidad a los antimicrobianos utilizados en la investigaci�n. Para las 12 colonias pertenecientes a las bacterias Gram negativas, el 23% presenta multirresistencia, el 23% presenta resistencia a 2 antibi�ticos, el 23% presenta resistencia a 1 antibi�tico y tan solo el 15% presenta sensibilidad a los antibi�ticos utilizados en la investigaci�n. Tanto S. aureus, Pseudomonas aureginosa y Aeromonas spp. son cepas multirresistentes, ya que son capaces de crecer en presencia de m�s de 3 antibi�ticos formando halos de inhibici�n de entre (0-8 mm). La resistencia bacteriana frente a los antibi�ticos de uso com�n en la actualidad es un problema grave de salud p�blica.

Los resultados obtenidos en la investigaci�n, al ser comparados con las normas de calidad del agua tanto a nivel nacional como internacional, indican que, desde el punto de vista microbiol�gico, el agua de la vertiente subterr�nea que distribuye el agua hacia la comunidad de Azactus posee una baja carga microbiana muy por debajo de los valores m�ximos establecidos, catalogando al agua como muy buena y utilizable para el consumo humano.

Sin embargo, existe la presencia de microorganismos potencialmente peligrosos que presentan resistencia y multirresistencia a antibi�ticos, de no ser controlados los par�metros microbiol�gicos habitualmente, podr�an representar un peligro para la comunidad en el futuro.

 

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� 2022 por los autores. Este art�culo es de acceso abierto y distribuido seg�n los t�rminos y condiciones de la licencia Creative Commons Atribuci�n-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional (CC BY-NC-SA 4.0)

(https://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/).